Maturação da afinidade de anticorpos de cadeia única contra o domínio de ligação ao receptor do SARS-CoV-2 e rastreamento por yeast surface display
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Data
2023-05-19
Autores
Orientador
Valentini, Sandro Roberto
Moreira, Tatiana Maria de Souza
Kadowaki, Marco Antônio Seiki
Coorientador
Pós-graduação
Curso de graduação
Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia - FCF
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Trabalho de conclusão de curso
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
A COVID-19 resultou em impactos sem precedentes à saúde humana e à sociedade, sendo
responsável por mais de 760 milhões de casos e 6,5 milhões de mortes em cerca de 3 anos e
meio após o primeiro caso registrado. O Brasil foi muito afetado pela doença, já que mesmo
possuindo apenas 2,7% da população mundial, foi responsável por mais de 10% dos casos que
resultaram em morte dos pacientes. Isso ocorreu devido a alguns fatores agravantes como o
atraso em estabelecer medidas de distanciamento social e na aquisição de vacinas. Apesar de
mais de 5 milhões de pessoas já estarem com o esquema vacinal completo, ainda é
imprescindível haver uma política de testagem para identificação e isolamento de infectados,
não só devido ao surgimento constante de novas variantes, como também em virtude da
Síndrome da COVID Longa. Tendo em vista essa necessidade de desenvolvimento de testes
diagnósticos que sejam rápidos, baratos, acurados e sensíveis, o presente trabalho propôs a
maturação da afinidade de fragmentos variáveis do anticorpo CC12.1, visando a obtenção de
um candidato altamente específico ao vírus SARS-CoV-2. Para isso, foi feita mutagênese por
saturação in silico desse anticorpo, determinando as trocas de resíduo mais promissoras para
um aumento da interação antígeno-anticorpo de acordo com o seu valor de variação da
energia livre (ΔΔG), as quais foram posteriormente testadas in vitro. Nesse processo, foram
obtidas 11 mutações a serem testadas, sendo que 9 delas potencialmente apresentariam uma
redução no ΔΔG, indicando uma melhora na estabilidade, e 2 foram usadas como contra-
prova. Ao final dos experimentos, 10 das mutações propostas foram clonadas em E. coli
DH5α, confirmadas por sequenciamento, transformadas em levedura S. cerevisiae EBY100 e
após indução de expressão, foram avaliadas pela técnica yeast surface display (YSD) por
citometria de fluxo. A partir dos resultados, os dois clones que apresentaram um maior
aumento de afinidade (LeveP95A e PesadaS31N), comparado ao scFv selvagem, bem como um
mutante de aumento intermediário (LeveS31Y), foram escolhidos para a realização de uma curva
de afinidade. Desta forma, o mutante LeveS31Y apresentou KD 3 vezes menor que o KD da
sequência selvagem, confirmando que a maturação in silico pode levar à obtenção de
fragmentos variáveis de maior afinidade ao RBD de SARS-CoV-2. A partir desses resultados,
a próxima etapa consiste em realizar uma curva de afinidade para todos os mutantes, bem
como uma combinação de mutações.
Resumo (português)
COVID-19 was responsible for the unprecedented impact on human health and society,
accounting for more than 760 million cases and 6.5 million deaths in about 3.5 years after the
first recorded case. Brazil was severely affected by the disease, considering that despite
having only 2.7% of the world's population, it was responsible for more than 10% of the
global cases that resulted high patient deaths. This was due to some aggravating factors such
as the delay in establishing social distancing measures and in acquiring vaccines. Even though
more than 5 million people have already complete the vaccination schedule, it is still essential
to have a testing policy for the identification and isolation of infected people, not only due to
the constant emergence of new variants, but also due to the Long COVID Syndrome. Given
this need to develop diagnostic tests that are fast, cheap and accurate, the present work
proposed the affinity maturation of variable fragment of the CC12.1 antibody, aiming to
obtain a highly virus-specific candidate. For this, mutagenesis by in silico saturation of the
antibody was performed, determining the most promising residue exchanges for an increase in
antigen-antibody interaction according to their variation of free energy value (ΔΔG), which
were later tested in vitro. In this process, 11 mutations were obtained to be tested, 9 of which
would potentially show a reduction in ΔΔG, indicating an improvement in stability, and 2
were tested as counterproof. At the end of the experiments, 10 of the proposed mutations were
cloned in E. coli DH5α, confirmed by sequencing, transformed into yeast S. cerevisiae
EBY100, and after expression induction they were evaluated by yeast surface display (YSD)
technique by flow cytometry. From the results, the two clones that showed a greater increase
in affinity (LeveP95A and PesadaS31N), compared to the wild-type scFv, as well as an
intermediate increased mutant (LeveS31Y), were chosen for the realization of an affinity curve.
In this experiment, the mutant LeveS31Y showed a KD 3 times lower compared to the same value
of the wild sequence, confirming that the in silico maturation is a viable approach to obtain
variable fragments with higher affinity to the SARS-CoV-2’s RBD. Therefore, the next step
obtain an affinity curve for all the mutantes, as well as test a combination of mutations.
Descrição
Idioma
Português