Desenvolvimento de modelo tridimensional de cultura celular para estudos de interação fungo-hospedeiro
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Data
2020-09-21
Autores
Orientador
Fusco Almeida, Ana Marisa
Moroz, Andrei
Coorientador
Pós-graduação
Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia - FCFAR
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Dissertação de mestrado
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (português)
A cultura em monocamada tem sido um método padrão e bem estabelecido para diferentes análises celulares in vitro, tais como testes de citotoxicidade, mutagenicidade, genotoxicidade e infecções celulares por microrganismos para estudos de doenças. Entretanto, uma das desvantagens desse método são as limitações impostas devido às discrepâncias biológicas entre a cultura em monocamada e o organismo vivo, tridimensional (3D). Existem diversos estudos na literatura que exemplifica a alta semelhança entre culturas 3D e organismos vivos, os quais tem o potencial de gerar dados complementares devido a maior complexidade observada nestes modelos propostos. O presente trabalho propõe o desenvolvimento um modelo alternativo para testes celulares, o qual será envolvido por uma matriz polimérica de alginato de sódio, perfazendo, assim, uma cultura de células 3D. Dessa forma, nessa dissertação, propõe-se uma análise adicional da interação fungo-hospedeiro, utilizando o patógeno Paracoccidioides brasiliensis (Pb18) como o organismo infectante, o qual até então fora estudado em modelos compostos por uma única camada celular, frequentemente denominada de monocamada. Para o preparo do modelo, uma suspensão de células A549 e MRC-5 foram adicionadas a uma solução de alginato de sódio que foi gotejada em outra solução (cloreto de cálcio) causando a microencapsulação das células em pérolas de alginato, as quais foram monitoradas diariamente em microscopia invertida com contraste de fase e fluorescência. Foram avaliados parâmetros como viabilidade celular (citotoxicidade), atividade metabólica, progressão do número de células (proliferação) utilizando diferentes métodos para ambas as células. Após esta caracterização inicial do modelo 3D, este foi infectado com P. brasiliensis por tempo a ser padronizado e as pérolas foram divididas para dois experimentos: i) verificação da presença do fungo dentro do arcabouço e sua possível interação com as células indicadas, utilizando microscopia confocal; ii) tentativa do isolamento do fungo de dentro da pérola e subsequente plaqueamento em meio de cultura próprio. O modelo proposto apresentou baixa citotoxicidade às células A549, indícios de aumento da densidade celular (indicativo de proliferação celular) e manutenção da viabilidade celular durante a maior parte do período de cultivo. Durante as análises de infecção utilizando microscopia confocal, foi possível verificar a presença do fungo dentro do arcabouço testado, o qual foi, então, isolado do mesmo e cultivado em meio de cultura, mostrando também que os componentes da matriz extra-celular possuem influencia no processo de infecção no modelo tridimensional proposto, além da célula A549 ter se mostrado ideal para estudos de interação tanto para o modelo 3D quanto para a monacamada.
Resumo (inglês)
Monolayer culture has been a standard and well-established method for different in vitro cell analyses, such as cytotoxicity, mutagenicity, genotoxicity and cellular infections by microorganisms for disease studies. However, one of the disadvantages of this method is the limitations imposed due to biological discrepancies between monolayer culture and the living tridimensional (3D) organismo. There are several studies in the literature that exemplify the high similarity between 3D cultures and living organisms, which have the potential to generate complementary data due to the greater complexity observed in these proposed models. The present work proposes the development of an alternative model for cellular tests, which will be surrounded by a polymeric matrix of sodium alginate, thus making a culture of 3D cells. Thus, in this dissertation, an additional analysis of the fungus-host interaction is proposed, using the pathogen Paracoccidioides brasiliensis (Pb18) as the infecting organism, which until then had been studied in models composed of a single cell layer, often called monolayer. For model preparation, a suspension of A549 and MRC-5 cells was added to a sodium alginate solution which was dripped into another solution (calcium chloride) causing cell microencapsulation in alginate pearls, which were monitored daily under inverted microscopy with phase contrast and fluorescence. Parameters such as cell viability (cytotoxicity), metabolic activity, progression of the number of cells (proliferation) were evaluated different methods for both cells. After this initial characterization of the 3D model, this was infected with P. brasiliensis for time to be standardized and the pearls were divided for two experiments: i) verification of the presence of the fungus within the framework and its possible interaction with the indicated cells, using confocal microscopy; ii) attempt to isolate the fungus from within the pearl and subsequent plating in its own culture medium. The proposed model showed low cytotoxicity to A549 cells, evidence of increased cell density (indicative of cell proliferation) and maintenance of cell viability during most of the culture time. During the analysis of infection using confocal microscopy, it was possible to verify the presence of the fungus within the tested framework, which was then isolated from it and grown in culture medium, also was observed that the components of the extra-cellular matrix have an influence on infection process in the three-dimensional model, in addition to the A549 cell presentes an ideal type of culture for interaction studies as the 3D model as the monolayer.
Descrição
Idioma
Português