Fatores de virulência do fungo Histoplasma capsulatum envolvidos na formação de biofilmes

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Data

2020-09-22

Autores

Fregonezi, Nathália Ferreira

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Editor

Universidade Estadual Paulista (Unesp)

Resumo

O fungo dimórfico Histoplasma capsulatum é o agente etiológico da histoplasmose, uma micose respiratória e sistêmica com casos distribuídos por todo o mundo. A patogenia da histoplasmose ocorre como resultado da inalação dos microconídeos da fase miceliar, que chegam primariamente aos pulmões, onde se transformam em leveduras, e, em seguida, podem se disseminar para outros órgãos. Diversos mecanismos podem estar envolvidos no processo de patogenia, permitindo o crescimento frente às diversas condições impostas pelo hospedeiro. Dentre estes, destaca-se os mecanismos para sobrevivência intracelular, e mais recentemente descrita, a capacidade de formar biofilmes. Desse modo, o objetivo desse trabalho foi avaliar o impacto da passagem por biofilmes na adesão e virulência das cepas EH-315 e G186A do fungo H. caspsulatum, além de avaliar o papel de diversas proteínas no estabelecimento desses biofilmes e na interação com o hospedeiro utilizando modelos in vitro e in vivo de infecção. Para a avaliação do perfil de virulência dos biofilmes durante a infecção, foram utilizadas as linhagens celulares A549 (epitelial pulmonar humano), J774 e RAW 264.7 (macrófagos murinos) e o modelo animal alternativo Galleria mellonela. Além disso, os biofilmes foram avaliados com relação a biomassa total, produção de matriz e atividade metabólica após o bloqueio das proteinas Enolase, 14-3-3, PL02996 e GAPDH, descritas como adesinas e importantes fatores de virulência para o gênero Paracoccidioides spp., e da proteína Hsp60, molécula de ligação de H. capsulatum aos macrófagos do hospedeiro, utilizando anticorpos específicos. O bloqueio das proteinas com seus respectivos anticorpos também foi utilizado como estratégia para avaliar a influência das proteínas na interação com o modelo G. mellonella. De acordo com os resultados obtidos, a cepa EH-315 demonstrou maior capacidade de interação com as células epiteliais pulmonares (A549) do que a cepa G186A, tanto após o cultivo planctônico (p<0,0001) quanto após a passagem por biofilme (p<0,05). Além disso, a passagem por biofilme aumentou a capacidade de interação em 32,26% para a cepa G186A, e 20,89% para a cepa EH-315. A interação com macrófagos também foi influenciada após a passagem por biofilme, tanto na interação com as células RAW 264.7, com aumento de 12,75% para a cepa G186A e 13,94% para a cepa EH-315, quanto na capacidade de proliferação intracelular em células J774, com aumento de 76,77% na proliferação após a passagem por biofilme na cepa EH-315. Apesar de ser capaz de estabelecer a infecção e reduzir a sobrevivência no modelo G. mellonella, não houve diferença significativa entre as curvas de sobrevivência das infecções com o fungo em cultivo planctônico e recuperado do biofilme. Entretanto, a passagem por biofilme induziu morte de forma mais precoce, e redução significativa (p<0,05) do número de hemócitos quando comparada com as larvas infectadas com o cultivo planctônico na cepa EH-315. Com relação à influência das proteínas nos biofilmes, o bloqueio das proteínas Enolase, 14-3-3, PL02996, Hsp60 e GAPDH ocasionou redução significativa da biomassa, conteúdo polissacarídico e atividade metabólica, demonstrando que são importantes para o processo de consolidação dos biofilmes. Com exceção da proteína 14-3-3 para a cepa EH-315, essas proteínas também parecem desempenhar papel importante para o estabelecimento da infecção no modelo alternativo G. mellonella, uma vez que o bloqueio levou ao aumento da sobrevivência das larvas (p<0,05). Mais estudos ainda precisam ser feitos para comprovar o papel dessas proteínas como novos fatores de virulência de H. capsulatum, porém, as proteínas estudadas demonstraram ser importantes na adesão ao substrato e formação dos biofilmes de H. capsulatum, e também para interação com o hospedeiro. Considerando a importância dos biofilmes do ponto de vista clínico, e a importância dos diferentes ligantes presentes no fungo interagindo com seus receptores no hospedeiro para o destino intracelular de H. capsulatum, o conhecimento do repertório de moléculas de superfície envolvidas com o processo de formação de biofilmes, bem como nas interações com as células do hospedeiro pode contribuir para uma melhor compreensão da biologia celular e virulência de H. capsulatum, além de providenciar novos alvos para serem explorados com abordagens antifúngicas. Além disso, os resultados encontrados demonstram evidências genéticas de similaridade em sequência, que sugerem a mesma atividade entre os fatores de virulência de Paracoccidioides spp. e H. capsulatum. Evidenciamos também a utilização do modelo G. mellonella para um posterior aprofundamento na avaliação da patogênese e perfil de resposta imunológica desencadeada por esse fungo.
The dimorphic fungus Histoplasma capsulatum is the etiological agent of histoplasmosis, a respiratory and systemic mycosis with worldwide distribution. The pathogenesis of histoplasmosis occurs as a result of microconidia inhalation, which primarily affects the lungs, where they turn into the yeast phase and can spread to other organs. Several mechanisms could be involved in the pathogenesis process, allowing growth in the face of host defense. Among these, the mechanisms for intracellular survival stand out, and, more recently described, the ability to form biofilms could contribute to virulence. Thus, this study aimed to evaluate the impact of the biofilms on the adhesion and virulence of the H. capsulatum EH-315 and G186A strains. Also, we evaluate the role of several proteins in the establishment of these biofilms and in the interaction with the host using in vitro and in vivo models of infection. To assess the virulence profile of biofilms during infection, cell lines A549 (human alveolar basal epithelial cells), J774 and RAW 264.7 (murine macrophages), and the alternative animal model Galleria mellonella were used. In addition, biofilms were evaluated for total biomass, matrix production, and metabolic activity after blocking the proteins Enolase, 14-3-3, PL02996, and GAPDH, described as adhesins and virulence factors for Paracoccidioides spp., and the protein Hsp60, an important binding molecule of H. capsulatum to host macrophages, using specific antibodies. The blockage of proteins with their respective antibodies was also used as a strategy to evaluate the influence of these proteins on the interaction with the G. mellonella model. According to the results, the EH-315 strain demonstrated a higher ability to interact with pulmonary epithelial cells (A549) than the G186A strain, in both planktonic (p <0.0001) and biofilm (p<0.05) cultures. Besides, the passage through biofilm increased the interaction capacity by 32.26% for the G186A strain, and 20.89% for the EH-315 strain. The interaction with macrophages was also influenced after passing through the biofilm, with an increase of 12.75% for the G186A strain and 13.94% for the EH-315 strain in RAW 264.7 cells, as well as in the intracellular proliferation capacity in J774 cells, with a 76.77% increase in proliferation after passage through biofilm in the EH-315 strain. Despite being able to establish the infection and reduce survival in the G. mellonella model, there was no significant difference between the survival curves of the infections with the fungus in planktonic and recovered from the biofilm. However, the passage through biofilm induced earlier death, in addition to inducing a significant reduction (p<0.05) in the number of hemocytes when compared to larvae infected with planktonic cultivation in the EH-315 strain. Regarding the influence of proteins on biofilms, blocking Enolase, 14-3-3, PL02996, Hsp60 and GAPDH caused a significant reduction in biomass, polysaccharide content, and metabolic activity, demonstrating that they are important for the process of consolidation of biofilms. Except for the 14-3-3 protein for the EH-315 strain, these proteins also appear to play an important role in establishing infection in the alternative model G. mellonella, since the blockade led to increased larval survival (p<0.05). Further studies still need to be done to prove the role of these proteins as new virulence factors for H. capsulatum. However, the studied proteins proved to be important in the adhesion to the substrate and formation of H. capsulatum biofilms, and also for interaction with the host. Considering the clinical aspects of the biofilms, and the importance of the different ligands and their receptors in the host for the intracellular fate of H. capsulatum, the knowledge of the repertoire of surface molecules involved in the biofilm formation, as well as interacting with host cells, can contribute to a better understanding of the cell biology and virulence of H. capsulatum, in addition to providing new targets to be explored with antifungal approaches. Also, the results demonstrate the correlation that may exist between the virulence factors of Paracoccidioides spp. and H. capsulatum. We also highlight the use of the G.mellonella model for further study of the pathogenesis and profile of the immune response triggered by this fungus.

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Palavras-chave

Biofilmes, Histoplasma capsulatum, Fatores de virulência, Galleria mellonella

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