Desenvolvimento de uma plataforma de purificação de L-asparaginase II de Aliivibrio fischeri produzida em Bacillus subtilis

A L-asparaginase II (L-ASNase II) é uma enzima comercialmente importante para a indústria farmacêutica devido ao seu emprego como biofármaco na terapia da Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA). No entanto, por se tratar de uma biomolécula exógena, comercialmente produzida pelas bactérias Escherichia coli e Dickeya dadantii, é comum a formação de anticorpos anti-asparaginase que levam a inativação da enzima durante a terapia. Com isso, torna-se necessário o desenvolvimento de novas fontes e métodos de produção dessa enzima. Além disso, o Brasil tem limitações referentes a aquisição de alguns desses medicamentos, sendo necessário realizar sua importação de países fabricantes, o que dificulta o acesso à população e torna-se, potencialmente, um problema de saúde pública. Assim, esse trabalho visou realizar a purificação da L-Asparaginase II de Aliviibrio fischeri produzida por Bacillus subtilis geneticamente modificado. Para isso, inicialmente, foi avaliada a produção da enzima por cultivo submerso em biorreator tanque agitado (4L e 300 RPM) e em agitador rotativo, em que o primeiro foi produziu um extrato enzimático com atividade de 1,15 ± 0,02 U.mL-1, valor 29,3% superior à obtida em agitador rotativo. Estabelecido a melhor plataforma de produção, foi avaliado o impacto da agitação na obtenção da biomolécula em biorreator tanque agitado (500 mL), em que a agitação de 500 RPM favoreceu sua produção, gerando um extrato enzimático com atividade 67,8% maior que a condição mais branda de 100 RPM. A partir da produção em biorreator, a recuperação inicial da enzima intracelular foi realizada com o auxílio de diferentes equipamentos para o rompimento mecânico celular, no qual o homogeneizador à alta pressão, operando por 15 ciclos a 82,7 mPa, liberou um extrato bruto com maior quantidade de proteínas e atividade de 1,81 ± 0,05 U.mL-1. Para a purificação de baixa resolução da L-ASNase presente no extrato, foi empregada precipitação com variados solventes orgânicos, no qual duas condições não tiveram diferença estatística em sua capacidade, que foi o etanol (razão 1:1 e 4h), com fator de purificação (F.P) de 7,48 ± 0,41 e recuperação 29,40 ± 0,93%, e o isopropanol (razão 1:1 e 1h), que alcançou F.P de 7,54 ± 0,32 e recuperação de 26,10 ± 0,95%. Quando avaliada a precipitação fracionada com os mesmos solventes, foi observado como a L-ASNase é, majoritariamente, recuperada em 40% (v.v-1), mantendo o mesmo patamar de F.P próximo a 7, mas com menor recuperação da enzima. Posteriormente, avaliou-se métodos cromatográficos com líquidos iônicos suportados, em que os resultados mostraram que esses compostos são uma alternativa para purificação da biomolécula alvo, em que o material Ssi[C3C1Im]Cl possibilitou alcance de F.P. de 8,45 ± 0,27 a partir do extrato bruto, operando a coluna como troca iônica com fase móvel composta por ácido bórico 50mM pH 9, com rendimento de 11,11 ± 0,36%. Ao avaliar a cromatografia de troca catiônica para purificação da enzima a partir do pré-purificado com isopropanol (40% v.v-1), foi recuperada 48,1% da L-ASNase, possibilitando o isolamento da enzima dos demais contaminantes, mas a uma baixa concentração final. Com isso, foi verificado o potencial de produção e purificação da L-ASNase II a partir de uma fonte alternativa, apontando sua viabilidade e potencial como base para o desenvolvimento de rotas nacionais de obtenção desse biofármaco.

Resumo (inglês)

L-asparaginase II (L-ASNase II) is a commercially important enzyme for the pharmaceutical industry due to its use as a biopharmaceutical in the treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL). However, as it is an exogenous biomolecule commercially produced by the bacteria Escherichia coli and Dickeya dadantii, the formation of anti-asparaginase antibodies is common, leading to enzyme inactivation during therapy. Therefore, the development of new sources and production methods for this enzyme is required. In addition, Brazil faces limitations regarding the acquisition of some of these medicines, making it necessary to import them from manufacturing countries, which restricts population access and potentially represents a public health issue. Thus, this study aimed to purify L-asparaginase II from Aliivibrio fischeri produced by genetically modified Bacillus subtilis. Initially, enzyme production was evaluated by submerged cultivation in a stirred-tank bioreactor (4 L, 300 RPM) and in a rotary shaker, with the bioreactor producing an enzymatic extract with an activity of 1.15 ± 0.02 U·mL⁻¹, which was 29.3% higher than that obtained in the rotary shaker. After establishing the best production platform, the impact of agitation on biomolecule production in a stirred-tank bioreactor (500 mL) was assessed, in which agitation at 500 RPM favored enzyme production, yielding an extract with 67.8% higher activity than the milder condition of 100 RPM. Following bioreactor cultivation, initial recovery of the intracellular enzyme was performed using different mechanical cell disruption devices, with high-pressure homogenization operating for 15 cycles at 82.7 MPa releasing a crude extract with higher protein content and activity of 1.81 ± 0.05 U·mL⁻¹. For low-resolution purification of L-ASNase from the extract, precipitation with different organic solvents was employed. Two conditions showed no statistical difference in performance: ethanol (1:1 ratio, 4 h), achieving a purification factor (PF) of 7.48 ± 0.41 and a recovery of 29.40 ± 0.93%, and isopropanol (1:1 ratio, 1 h), which reached a PF of 7.54 ± 0.32 and a recovery of 26.10 ± 0.95%. When fractional precipitation with the same solvents was evaluated, L-ASNase was predominantly recovered at 40% (v·v⁻¹), maintaining a similar PF of approximately 7, albeit with lower enzyme recovery. Subsequently, chromatographic methods using supported ionic liquids were investigated, and the results demonstrated that these compounds represent an alternative for purification of the target biomolecule. The material Ssi[C3C1Im]Cl enabled a PF of 8.45 ± 0.27 directly from the crude extract, operating the column in ion-exchange mode with a mobile phase composed of 50 mM boric acid at pH 9, yielding 11.11 ± 0.36%. When cation-exchange chromatography was evaluated for enzyme purification from the isopropanol pre-purified fraction (40% v·v⁻¹), 48.1% of L-ASNase was recovered, allowing isolation of the enzyme from other contaminants, albeit at a low final concentration. Overall, the potential for production and purification of L-ASNase II from an alternative source was demonstrated, indicating its feasibility and potential as a basis for the development of national routes for obtaining this biopharmaceutical.

Palavras-chave

Biorreatores, Analise cromatografica, Precipitação com solvente orgânico, Fator de purificação, Líquidos iônicos, Líquidos iônicos suportados, Cromatografia, Bioreactor, Organic solvent precipitation, Purification factor, Supported ionic liquids, Chromatography

Idioma

Português

Citação

CORVELLO, Enzo. Desenvolvimento de uma plataforma de purificação de L-asparaginase II de Aliivibrio fischeri produzida em Bacillus subtilis. 2026. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Araraquara, 2026.