Estudo do secretoma de biofilmes simples e mistos de Candida albicans e Staphylococcus aureus na resposta inflamatória e na expressão gênica de células displásicas de cavidade oral

Os biofilmes são comunidades microbianas, que podem coexistir de forma sinérgica ou antagônica. Nos seres humanos, cerca de 80% dos processos infecciosos patogênicos estão relacionados ao desenvolvimento de biofilmes. Este trabalho tem como foco a espécie fúngica Candida albicans e a bactéria Staphylococcus aureus, ambos micro-organismos presentes em indivíduos saudáveis, que em determinadas condições clínicas, podem se tornar patogênicos, sobretudo na forma de biofilmes. Tais espécies são capazes de formar biofilmes de difícil controle e tratamento, sobretudo devido às interações moleculares e à produção de toxinas. Neste sentido, este projeto avaliou a ação biológica do secretoma, de biofilmes simples e mistos de C. albicans e S. aureus, usando também como ferramenta, mutantes de C. albicans com deleções em genes relacionados aos principais fatores de virulência deste fungo, a cepa ece1Δ/Δ, incapaz de secretar candidalisina, a cepa als3Δ/Δ, incapaz de produzir a adesina Als3p, e a cepa efg1Δ/Δ/cph1Δ/Δ, incapaz de formar hifas. Tais biofilmes foram formados por 36 horas e caracterizados, através da contagem de unidade formadoras de colônia (UFC/mL), quantificação de carboidratos, lipídeos e proteínas secretadas, avaliados morfologicamente por Microscopia de Fluorescência Confocal (CLSM) e por capacidade hemolítica. O secretoma, obtido dos diversos biofilmes deste estudo, foi utilizado para estimular as células THP-1 naive. Estas células foram avaliadas por CLSM, quanto à expressão de receptores de superfície do tipo CD86+ (fenótipo M1) e CD163+ (fenótipo M2) e quanto à produção das citocinas IL-8; IL-1β; IL- 6; IL-10; TNF e IL-12p70, por Citometria de Fluxo. Finalmente, o meio condicionado das células THP-1 estimuladas (mcTHP-1), foi utilizado para desafiar as células de displasia de cavidade oral, DOK, em relação à modulação da expressão gênica, (RT-qPCR), dos genes: TP53, HRAS, AKT, STAT3, BCL2, BRAF, mTOR e PI3KCA. Como resultados principais, evidenciamos que o secretoma do biofilme simples de S. aureus foi capaz de induzir a polarização das células THP-1 para um fenótipo CD86+, além de estimular a produção de TNF, IL-1β e IL-8 nestas células. Nos biofilmes mistos, tais capacidades de S. aureus foram abolidas por C. albicans, mecanismos parcialmente revertidos na presença do mutante als3Δ/Δ e totalmente revertidos na presença do mutante efg1Δ/Δ/cph1Δ/Δ; comprovando que C. albicans inibiu a antigenicidade do secretoma de S. aureus via Als3p e primordialmente através da formação de hifas. Além disto, o secretoma de S. aureus foi capaz, via modulação das células THP-1, de regular negativamente a expressão de TP53 e positivamente a expressão de BCL2, nas células DOK. Tal capacidade, novamente, foi inibida pela presença de C. albicans nos cultivos mistos com S. aureus, e discretamente revertida pelos mutantes als3Δ/Δ e efg1Δ/Δ/cph1Δ/Δ. Assim, este trabalho demonstra, pela primeira vez, a ação inibitória de C. albicans sobre S. aureus, na modulação da resposta inflamatória e na expressão de oncogenes. Este trabalho descreve que estes mecanismos estão atrelados à produção da adesina Als3p assim como à formação de hifas por C. albicans. Finalmente, este trabalho descreve a capacidade pró-inflamatória e pró-tumoral do secretoma de S. aureus.

Resumo (inglês)

Biofilms are microbial communities that can coexist synergistically or antagonistically. In humans, approximately 80% of pathogenic infectious processes are associated with biofilm development. This study focuses on the fungal species Candida albicans and the bacterium Staphylococcus aureus, both of which are present in healthy individuals but can, under certain conditions, transition into a pathogenic biofilm form. These species are capable of forming biofilms that are difficult to control and treat, mainly due to complex molecular interactions and toxin production. In this project, we evaluated the biological activity of the secretome from single and dual-species biofilms of C. albicans and S. aureus, also using C. albicans mutants, as tools, to study specific fungal virulence factors. The mutants included the ece1Δ/Δ strain, incapable of secreting candidalysin; the als3Δ/Δ strain, deficient in Als3p production; and the efg1Δ/Δ/cph1Δ/Δ strain, incapable of forming hyphae. Biofilms were grown for up to 36 hours and characterized by colony-forming unit (CFU/mL) counts, quantification of carbohydrates, lipids, and proteins, morphological analysis by confocal laser scanning microscopy (CLSM), and hemolytic activity on blood agar. The obtained secretomes were also used to stimulate naïve THP-1 monocytic cells. After stimulation, these cells were evaluated by CLSM for surface markers CD86+ (M1 phenotype) and CD163+ (M2 phenotype), and by flow cytometry for cytokine production, including IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF, and IL-12p70. Finally, the conditioned medium from the stimulated THP-1 cells (mcTHP-1) was used to challenge dysplastic oral keratinocytes (DOK cells), evaluating the modulation of gene expression (by RT-qPCR) for TP53, HRAS, AKT, STAT3, BCL2, BRAF, mTOR, and PI3KCA. Our main results demonstrated that the secretome from single-species S. aureus biofilms was able to induce THP-1 polarization towards a CD86+ phenotype and stimulate the production of TNF, IL-1β, and IL-8. However, in dual-species biofilms, these S. aureus-induced effects were abolished by C. albicans. The suppression of cytokine production (TNF, IL-1β, and IL-8) was partially reversed in the presence of the als3Δ/Δ mutant and fully reversed with the efg1Δ/Δ/cph1Δ/Δ mutant, demonstrating that C. albicans inhibited the antigenicity of the S. aureus secretome through Als3p function and, predominantly, hypha formation. Moreover, the S. aureus secretome was able, via THP-1 cell modulation, to downregulate TP53 expression and upregulate BCL2 expression in DOK cells. This effect was also inhibited by the presence of C. albicans in dual biofilms and partially reversed when the als3Δ/Δ and efg1Δ/Δ/cph1Δ/Δ mutants were used. In summary, this work demonstrates, for the first time, the inhibitory role of C. albicans on the S. aureus secretome in modulating the inflammatory response and oncogene expression. These mechanisms are associated with the production of the Als3p adhesin and, most importantly, with hypha formation by C. albicans. Finally, this study highlights the pro-inflammatory and pro-tumorigenic potential of the S. aureus secretome.

Palavras-chave

Cândida albicans, Staphylococcus aureus, Biofilmes, Secretoma, TNF, IL-1β, BCL2, TP53, Biofilm, Secretome

Idioma

Português

Citação

DETT, Freddy Humberto Marin. Estudo do secretoma de biofilmes simples e mistos de Candida albicans e Staphylococcus aureus na resposta inflamatória e na expressão gênica de células displásicas de cavidade oral. 2025. 125 f. Tese (Doutorado em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia) – Universidade Estadual Paulista(UNESP), Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Araraquara, 2025.