Investigação de genes que codificam as bombas de efluxo em biofilmes e células persisters de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii
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Data
2024-12-06
Autores
Orientador
Almeida, Ana Marisa Fusco 
Coorientador
Giannini, Maria José Soares Mendes
Pós-graduação
Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia - FCF
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Dissertação de mestrado
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
A criptococose é uma doença fúngica sistêmica caracterizada clinicamente por acometer indivíduos imunocomprometidos (principalmente C. neoformans) e imunocompetentes (principalmente C. gattii), afetando o trato respiratório inferior e em muitos casos o sistema nervoso central. A resistência aos antifúngicos dificulta o tratamento dessas infecções. Dentre os mecanismos de resistência dos fungos destacam-se a expressão de bombas de efluxo, mutações na enzima-alvo de azóis, a formação de biofilmes e a presença de células persisters. O objetivo foi avaliar a expressão de genes de bomba de efluxo e seus efeitos nos biofilmes e células persisters de C. neoformans e C. gattii, para o delineamento de novos alvos específicos. Foram realizadas: microscopias; caracterização dos biofilmes na cinética de formação, comparando as duas espécies; o tratamento dos biofilmes; a recuperação, a indução e a avaliação da concentração inibitória mínima e fungicida das células persisters; a quantificação relativa dos genes-alvo (genes de bomba de efluxo – AFR1, AFR2, AFR3 e MDR1) nas condições planctônica, biofilme e persister. Os compostos selecionados para os tratamentos foram: anfotericina B; fluconazol; o inibidor de calcineurina e bombas de efluxo FK506; um derivado do ácido protocatecuico, octila. Os biofilmes das duas espécies formaram estruturas complexas, robustas e bem estabelecidas, mostrando níveis crescentes dos componentes da biomassa e da heterogênea e densa matriz extracelular, mediados pela superexpressão de bombas de efluxo. Os tratamentos destacaram a eficácia das combinações de fluconazol com FK506 e octila, danificando os biofilmes. Esses resultados implicaram numa notável relação das bombas de efluxo com o auxílio no transporte dos principais componentes extracelulares. Nossos resultados e a literatura nos mostraram que as bombas de efluxo possuem papéis multifacetados e variados, não somente participando ativamente da resistência, mas também no desenvolvimento estrutural e fisiologia dos biofilmes. As células persisters de ambas as espécies de Cryptococcus apresentaram baixa atividade metabólica durante o isolamento pelo tratamento com 100 μg/mL de anfotericina B nos biofilmes e cresceram posteriormente de maneira lenta e gradual. As combinações de fluconazol com FK506 e principalmente octila reduziram significativamente a concentração inibitória mínima das células persisters. A proliferação dessas células, os tratamentos com fluconazol e a quantificação dos genes-alvo indicaram a reativação das bombas de efluxo. Nossos resultados ajudaram a identificar mecanismos de resistência de biofilmes, a existência de células persisters das espécies de C. neoformans e C. gattii e novas alternativas terapêuticas no contexto da criptococose.
Resumo (inglês)
Cryptococcosis is a systemic fungal disease clinically characterized by affecting immunocompromised individuals (mainly C. neoformans) and immunocompetent individuals (mainly C. gattii), involving the lower respiratory tract and, in many cases, the central nervous system. Antifungal resistance complicates the treatment of these infections. Among the fungal resistance mechanisms, notable features include the expression of efflux pumps, mutations in the azole-target enzyme, biofilm formation, and the presence of persister cells. The aim was to evaluate the expression of efflux pump genes and their effects on biofilms and persister cells of C. neoformans and C. gattii to outline new specific targets. The following were conducted: microscopy analyses; biofilm characterization in the kinetics of formation, comparing both species; biofilm treatments; recovery, induction, and evaluation of the minimum inhibitory and fungicidal concentrations of persister cells; and relative quantification of target genes (efflux pump genes – AFR1, AFR2, AFR3, and MDR1) in planktonic, biofilm, and persister conditions. The selected compounds for the treatments included amphotericin B, fluconazole, the calcineurin and efflux pump inhibitor FK506, and an octyl derivative of protocatechuic acid. The biofilms of both species formed complex, robust, and well-established structures, exhibiting increasing levels of biomass components and a heterogeneous, dense extracellular matrix, mediated by the overexpression of efflux pumps. The treatments highlighted the effectiveness of fluconazole combined with FK506 and octyl, which damaged the biofilms. These results indicated a notable relationship between efflux pumps and their role in transporting major extracellular components. Our results and the literature showed that efflux pumps have multifaceted and diverse roles, actively participating not only in resistance but also in the structural development and physiology of biofilms. Persister cells of both Cryptococcus species exhibited low metabolic activity during isolation via treatment with 100 μg/mL amphotericin B in biofilms and later grew slowly and gradually. The combinations of fluconazole with FK506, and especially octyl, significantly reduced the minimum inhibitory concentration of persister cells. The proliferation of these cells, treatments with fluconazole, and quantification of target genes indicated the reactivation of efflux pumps. Our findings helped identify biofilm resistance mechanisms, the existence of persister cells in C. neoformans and C. gattii species, and new therapeutic alternatives in the context of cryptococcosis.
Descrição
Palavras-chave
Idioma
Português
Como citar
PIMENTA, G.R. Investigação de genes que codificam as bombas de efluxo em biofilmes e células persisters de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. 2024. 122 f. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Araraquara, 2024.